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一起来了解一下什么是金担子素A
   金担子素A(Aureobasidin A,AbA)是从丝状真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分离出来的环酯肽类抗生素,具有很强的抗真菌能力。在较低的浓度下(0.1-0.5 μg/ml)即可对酵母产生毒性。对其敏感的真菌种类包括:出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。作用机制在于AbA抑制了真菌生长所依赖的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干扰鞘脂合成,从而进一步杀死菌株。编码IPC合成酶的基因研究较多的有来自酿酒酵母菌的AUR1 基因,以及构巢曲霉的AURA基因,两者具有同源性。通过对这些编码基因进行突变即可使得菌株对AbA产生抗性,如AUR1-C基因。

  AbA非常适合用作阳性克隆子筛选用的药物选择性标记。AbA抗性也是酵母单/双杂交研究中理想的报告子。本品为溶于甲醇的AbA溶液,浓度为1 mg/ml。具体的工作浓度取决于宿主细胞的敏感度(见表1. AbA对各种酵母菌的最低抑菌浓度(MIC))。

  金担子素A的操作步骤(抗AbA的酵母转化系统)

  1)加入0.5 ml过夜培养的酵母到50 ml YPD培养基中(配方:1L液体培养基含有10g yeast extract,20g polypeptone, 20g D-glucose;固体培养基另外加入2%琼脂;)。

  2)30℃培养约6小时,测定OD660为1~2。使用二倍体时,测定OD660为2~4。

  3)1,000×g离心5分钟。

  4)用10 ml Solution A(配方:100 mM Lithium acetate,10 mM Tris-HCl pH 7.5,1 mM EDTA)悬浮沉淀,1,000×g离心5分钟。

  5)用Solution A重悬沉淀,直到OD660为150。

  6)在管内分取100 µl细胞悬浮液,30℃培养1小时。

  7)加入5 µg载体(环状或线性DNA)和150 µg Carrier DNA,100℃加热10分钟,迅速冷却。

  注:pAUR101需使用线性DNA进行转化。使用环状DNA会降低转化效率甚至转化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的质粒DNA进行转化。

  8)加入850 µl Solution B(配方:取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解,需要现用现配),轻轻混匀。

  9)30℃培养30分钟后,42℃培养15分钟。

  10)室温放置10分钟。

  11)5,000 rpm离心1分钟,用5 ml YPD培养基悬浮沉淀。

  12)30℃培养6小时~过夜。

  13)5,000~10,000 rpm离心,用1-10 ml 0.9% NaCl悬浮沉淀。

  14)在YPD选择培养基平板(含有一定浓度的AbA,依菌株类型而定)上接种100 µl细胞悬液。30℃培养3-4天后转化完成。

  15)挑取阳性转化子,和/或测定转化效率(以每微克质粒DNA转化的菌落数来表示)。

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